Новости химической науки > Метод измерения активности отдельного фермента

Исследователи из Кореи разработали дешевый метод, позволяющий изучать кинетику ферментативной реакции на примере одиночной молекулы. Новый метод может серьезно понизить стоимость исследований, связанных с ферментативной генетической терапией и упростить разработку лекарственных препаратов.

Система ALEX-FRET позволяет определить соотношение расщепленных и нерасщепленных субстратов. (Рисунок из Chem. Commun., 2010, 46, 4683)

Для изучения динамики структурных преобразований различных биологически активных молекул широко применяются методы исследования отдельных молекул. Для подобного испытания обычно требуется небольшое количество образца, эти методы являются быстрой и дешевой составной частью кинетических измерений для многих приложений, как, например, аналитические системы, терапевтические исследования и молекулярные логические ворота. Для изучения отдельных молекул обычно применяется электрофорез в геле, при этом в структуру субстратов вводят определенные маркеры, в том числе – флуорогенные, хромогенные или радиоактивные метки. К сожалению, такой подход часто ограничивается тем, что он сложен в практической реализации, а также отличается низкой производительностью.

Введение метки также применяется в методе флуоресцентного резонансного энергетического переноса [fluorescence resonance energy transfer (FRET)], этот метод применяется в качестве спектроскопической «линейки» для измерения между фрагментами молекулы, содержащими метки-красители (обычно донором и акцептором). Молекула донора детектируется при его возбуждении в результате диссоциации; при сближении акцептора с донором (на расстояние, не превышающее 7 нм) их взаимодействие может быть зафиксировано. Подобный подход позволяет изучать конформационные переходы, происходящие в структуре белка, а также исследовать взаимодействие белок/белок и белок/нуклеиновая кислота, с высокой точностью регистрируя кинетические закономерности процесса в режиме реального времени. Однако недостатками метода FRET являются потенциальное затухание сигнала от флуорофора, трудности и высокая стоимость введения метки.

Для преодоления проблем, описанных выше, в группе Сеонга Кеуна Кима (Seong Keun Kim) из Национального Университета Сеула использовали метод переменного лазерного возбуждения флуоресцентного резонансного энергетического переноса[alternating laser excitation FRET (ALEX-FRET)], который был использован для измерения соотношения красителей (позволяющих эффективно различить расщепленные и нерасщепленные субстраты) с эффективностью, характерной для FRET. Исследователи из группы Кима пометили два конца субстрата-дезоксирибозима двумя различными флуорофорными красителями, после чего запустили ферментативную реакцию, введя катион магния(II) в систему, содержащую фермент. Система ALEX-FRET позволила исследователям определить концентрацию неизмененного фермента как функцию времени и рассчитать скорость протекания ферментативной реакции. Новая аналитическая система позволяет избежать затухания флуоресцентного излучения за счет постоянного пополнения субстрата с введенной меткой.

Ким поясняет, что новый подход позволяет измерять активность отдельной молекулы фермента в режиме реального времени, существенно понижая количество образца, необходимое для анализа (более чем в 100 раз). Метод ALEX-FRET превосходит по многим показателям обычные методы FRET.

Йи Лю (Yi Lu), эксперт по химической биологии из Университета Иллинойса отмечает, что новая работа является прекрасным примером демонстрации того, как FRET одной молекулы позволяет глубже изучить особенности работы нового класса металлоферментов, добавляя, что исследования с помощью этого метода позволили изучить влияние ионов металлов на самоорганизацию и активность дезоксорибозима, предполагая, что метод окажется полезным и для других ферментных систем.

Источник: Chem. Commun., 2010, 46, 4683, DOI: 10.1039/c002666b

метки статьи: #аналитическая химия, #биохимия, #кинетика и катализ, #медицинская химия, #молекулярная биология, #физическая химия